Мультифокальды жазықтық микроскопиясы - Multifocal plane microscopy

Көпфокалды жазықтық микроскоптың схемасы.

Мультифокальды жазықтық микроскопиясы (MUM) немесе Мультипландық микроскопия немесе Қос жазықтықтағы микроскопия жарықтың бір түрі микроскопия бұл тірі жасушаларда 3D динамикасын жоғары уақыттық және кеңістіктік рұқсат бір уақытта үлгінің ішіндегі әртүрлі фокустық жазықтықтарды бейнелеу арқылы.[1][2][3][4] Бұл әдістемеде сынамадан алынған жарық шексіздікпен түзетілген объективті объектив екі жолға бөлінеді.[5] Әр жолда сплит жарық түтік линзасынан белгілі бір калибрленген қашықтықта орналасқан детекторға бағытталған. Осылайша, әрбір детектор үлгідегі нақты жазықтықты бейнелейді. Бірінші дамыған MUM қондырғысы үлгідегі екі нақты жазықтықты бейнелеуге қабілетті болды. Дегенмен, әр жарық жолындағы жарықты әрі қарай бөліп, оны белгілі бір калибрленген қашықтықта орналасқан детекторларға бағыттау арқылы қондырғыны екіден астам жазықтықта өзгертуге болады. Мультифокустық микроскопия (MFM) деп аталатын тағы бір әдіс дифрактивті Фурье оптикасын 25 фокустық жазықтыққа дейін бейнелеу үшін қолданады.[6][7] Қазіргі уақытта MUM қондырғылары төрт жазықтыққа дейін бейнелеуге мүмкіндік береді.[8][9]

Кіріспе

Флуоресценттік микроскопия тірі жасушалардың адам саудасы оқиғаларын зерттеудің негізгі құралы болып табылады. Кәдімгі микроскоп дизайны екі өлшемді, яғни фокустық жазықтықта жылдам жасушалық динамиканы бейімдеуге бейімделген. Алайда, жасушалар үш өлшемді объектілер болып табылады және жасуша ішілік сауда жолдары әдетте бір фокустық жазықтықпен шектелмейді. Егер динамика бір фокустық жазықтықпен шектелмесе, үш өлшемді жылдам жасушаішілік динамиканы егжей-тегжейлі зерттеу үшін әдеттегі бір жазықтықты микроскопия технологиясы жеткіліксіз. Фокустық жазықтықты өзгертуге негізделген классикалық тәсілдер көбінесе мұндай жағдайда тиімді болмайды, өйткені фокустау құрылғылары көптеген жасуша ішіндегі динамикамен салыстырғанда баяу. Сонымен қатар, фокустық жазықтық жиі орынсыз уақытта болуы мүмкін, осылайша динамикалық оқиғалардың маңызды аспектілері жоғалады.

Іске асыру

MUM кез-келген стандартта жүзеге асырылуы мүмкін жарық микроскопы. Цейсс микроскопында іске асырудың мысалы келесідей.[10] Zeiss Axiovert 200 микроскопының бүйір портына алдымен Zeiss қос-бейне адаптері бекітілген. Содан кейін екі Zeiss қос бейне адаптері олардың әрқайсысын бірінші Zeiss бейне адаптерінің шығыс порттарына бекіту арқылы біріктіріледі. Біріктірілген бейне адаптердің әрқайсысына жоғары ажыратымдылық CCD камерасы C-mount / spacer сақиналарын және арнайы өңделген камера байланыстыру адаптерін қолдану арқылы бекітіледі. Бейне адаптердің шығыс порты мен камераның арасындағы қашықтық әр камера үшін әр түрлі болады, нәтижесінде камералар нақты фокустық жазықтықтарды бейнелейді.

MUM-ны жүзеге асырудың көптеген тәсілдері бар екенін айта кеткен жөн. Аталған бағдарлама икемділік, орнатудың және қызмет көрсетудің қарапайымдылығы, әртүрлі конфигурациялар үшін реттелу сияқты бірнеше артықшылықтарды ұсынады. Сонымен қатар, бірқатар қосымшалар үшін әр түрлі түстердегі кескіндерді алу мүмкіндігі өте маңызды экспозиция уақыты. Мысалы, экзоцитозды көру үшін TIRFM, өте тез сатып алу қажет. Алайда, флуоресцентті стационарлық органелланы жасушада бейнелеу үшін фототағартуды болдырмау үшін аз қозу қажет, нәтижесінде сатып алу баяу жүруі керек.[11] Осыған байланысты жоғарыда аталған іске асыру үлкен икемділікті ұсынады, өйткені әр түрлі камераларда әр түрлі арналардағы кескіндерді алуға болады.

MUM көмегімен 3D-супер ажыратымдылықты бейнелеу және бір молекуланы бақылау

MUM тереңдігін кемсітуді әдеттегі бір жазықтықтағы микроскопиямен салыстыру.

Қазіргі микроскопия әдістері жасушалық процестерді бір молекула деңгейінде зерттеуге үлкен қызығушылық тудырды. Бір молекулалық эксперименттер орташаланған эффекттерді жеңеді, сондықтан әдеттегі жаппай зерттеулердің көмегімен қол жетімді емес ақпарат береді. Алайда, бір молекулалардың 3D локализациясы мен қадағалауы бірнеше қиындықтар тудырады. Бірыңғай молекуланың кескіндерін, оның ықтимал өте күрделі 3D динамикасынан өту кезінде алуға бола ма, жоқ па, сонымен қатар, бір молекуланың 3D орналасуын анықтауға бола ма, жоқ па және мұны қаншалықты дәл жасауға болады деген сұрақ туындайды.

3D орналасуын жоғары дәлдікпен бағалауға үлкен кедергі стандартты микроскоптың терең дискриминациясы болып табылады.[12] Тіпті жоғары сандық апертура объективті, а бейнесі нүкте көзі кәдімгі микроскопта нүкте көзі фокустық жағдайынан бірнеше жүз нанометрге жылжытылған жағдайда айтарлықтай өзгермейді. Бұл әдеттегі микроскоппен нүктелік көздің осьтік, яғни z жағдайын анықтауды өте қиын етеді.

Жалпы алғанда, 3D үлгілерге арналған сандық бір молекулалық микроскопия қосымшаны оқшаулау / қадағалау ма, жоқ әлде бірдей проблема тудырады супер ажыратымдылықтағы микроскопия мысалы, 3D қосымшаларына арналған PALM, STORM, FPALM, dSTORM, яғни үш өлшемде бір молекуланың орналасуын анықтау.[13] MUM бірнеше артықшылықтарды ұсынады.[14] MUM-да нүктелік көздің суреттері бір уақытта әртүрлі фокустық деңгейде алынады. Бұл кескіндер нүктелік көздің z жағдайын шектеу үшін қолданылатын қосымша ақпарат береді. Бұл шектеулі ақпарат негізінен фокустың жанындағы терең дискриминация проблемасын жеңеді.

3D локализация өлшемі орналасқан жердің дәлдігін сандық өлшеуді қамтамасыз етеді нүкте көзі анықталуы мүмкін. 3D оқшаулау өлшемінің кіші сандық мәні орналасқан жерді анықтауда өте жоғары дәлдікті білдіреді, ал 3D локализация өлшемінің үлкен сандық мәні орналасқан жерді анықтауда өте нашар дәлдікті білдіреді. Кәдімгі микроскоп үшін нүкте көзі фокус жазықтығына жақын болған кезде, мысалы, z0 <= 250 нм, локализацияның 3D өлшемі z жағдайын бағалауда өте нашар дәлдікті болжайды. Осылайша, кәдімгі микроскопта нүктелік көз фокус жазықтығына жақын болған кезде 3D бақылауды жүргізу қиынға соғады.

Екінші жағынан, MUM екі жазықтығы үшін 3D оқшаулау шарасы әдеттегі микроскопқа қарағанда z-мәндерінің диапазонына қарағанда дәлдікті үнемі жақсырақ болжайды, әсіресе нүкте көзі фокус жазықтығына жақын болған кезде. Осы нәтиженің бірден-бір қорытындысы - z-мәнінің диапазоны үшін нүктелік көздің салыстырмалы дәлдік деңгейімен анықтауға болады, бұл 3D үшін қолайлы бір бөлшектерді бақылау.

Қос объективті мультифокальды жазықтық микроскопиясы (dMUM)

Қос объективті көпфокалды жазықтық микроскопы (dMUM).

Бөлшектерді бейнелеудің бірыңғай қосымшаларында люминесцентті затбелгіден анықталған фотондар саны алынған мәліметтерді сандық талдауда шешуші рөл атқарады. Қазіргі кезде бөлшектерді қадағалау тәжірибелері әдетте инвертирленген немесе тік микроскопта жүргізіледі, онда бір объективті линза үлгіні жарықтандырады, сонымен қатар одан флуоресценция сигналын жинайды. Үлгіден флуоресценцияның шығуы барлық бағыттарда (яғни, сынаманың үстінде және астында) жүрсе де, осы микроскоптың конфигурацияларында бір объективті линзаны қолдану үлгінің тек бір жағынан жарық жинауға әкелетініне назар аударыңыз. Тіпті жоғары сандық апертуралы объективтік линза қолданылғанның өзінде, объективті линзаның ақырғы жиналу бұрышына байланысты үлгінің бір жағында шығарылған фотондардың барлығын жинауға болмайды. Осылайша, бейнелеудің ең жақсы жағдайында да әдеттегі микроскоптар үлгіні шығаратын фотондардың тек бір бөлігін ғана жинайды.

Бұл мәселені шешу үшін микроскоптың конфигурациясын қолдануға болады, онда екі қарама-қарсы объективті линзалар қолданылады, мұнда мақсаттардың бірі инверттелген күйде, ал екіншісі тік күйде орналасқан. Бұл конфигурация қос объективті мультифокальды жазықтық микроскопиясы (dMUM) деп аталады.[15]

Пайдаланылған әдебиеттер

  1. ^ Прабхат, П .; Рам, С .; Уорд, Е.С .; Обер, Р.Ж. (2004). «Үш өлшемді жасушалық динамиканы зерттеу үшін флуоресценттік микроскопияда әртүрлі фокустық жазықтықтарды бір уақытта бейнелеу». NanoBioscience бойынша IEEE транзакциялары. 3 (4): 237–242. дои:10.1109 / TNB.2004.837899. PMC  2761735. PMID  15631134.
  2. ^ Прабхат, П .; Рам, С .; Уорд, Е.С .; Обер, Р.Ж. (2006). Кончелло, Хосе-Анхель; Когсвелл, Кэрол Дж; Уилсон, Тони (ред.) «Флюоресценттік микроскопияда бірнеше фокустық жазықтықты бір уақытта 3D жасушалық динамиканы зерттеу үшін бейнелеу». SPIE туралы материалдар. Үшөлшемді және көпөлшемді микроскопия: кескін алу және өңдеу XIII. 6090: 115–121. дои:10.1117/12.644343. S2CID  119772837.
  3. ^ Дехмельт, Лейф; Bastiaens, Philippe I. H. (2010). «Жасушаішілік қарым-қатынасты кеңістіктік ұйымдастыру: бейнелеуден түсінік». Молекулалық жасуша биологиясының табиғаты туралы шолулар. 11 (6): 440–452. дои:10.1038 / nrm2903. PMID  20485292. S2CID  12262683.
  4. ^ Тахмасби, А .; Рам, С .; Чао, Дж .; Авраам, А.В .; Тан, Ф.В .; Уорд, Е.С .; Обер, Р.Ж. (2014). «Көпфокалды жазықтық микроскопиясына арналған фокустық жазықтық аралығын жобалау». Optics Express. 22 (14): 16706–16721. Бибкод:2014OExpr..2216706T. дои:10.1364 / OE.22.016706. PMC  4162350. PMID  25090489.
  5. ^ Бадиейростами, М .; Лью, MD; Томпсон, М.А .; Moerner, W.E. (2010). «Екі спиральды нүктенің таралу функциясының астигматизм мен бипланға қарсы үш өлшемді оқшаулау дәлдігі». Қолданбалы физика хаттары. 97 (16): 161103. Бибкод:2010ApPhL..97p1103B. дои:10.1063/1.3499652. PMC  2980550. PMID  21079725.
  6. ^ Абрахамссон, Сара; Чен, Джидзи; Хаж, Бассам; Сталлинга, Джоерд; Катсов, Александр Ю; Вишневский, қаңтар; Мизугучи, Гаку; Суль, Пьер; Мюллер, Флориан (2012 ж. 1 қаңтар). «Аберрациямен түзетілген мультифокустық микроскопияны қолданатын жылдам түсті 3D кескіні». Табиғат әдістері. 10 (1): 60–63. дои:10.1038 / nmeth.2277. PMC  4161287. PMID  23223154.
  7. ^ Абрахамссон, Сара; МакКилкен, Молли; Мехта, Шалин Б .; Верма, Амитабх; Ларш, Йоханнес; Илис, Роб; Хайнцман, Райнер; Баргманн, Корнелия I .; Гладфелтер, Эми С. (1 қаңтар 2015). «MultiFocus поляризация микроскопы (MF-PolScope) бір уақытта 25 фокустық жазықтыққа дейінгі 3D поляризациялы бейнелеу үшін». Optics Express. 23 (6): 7734–7754. Бибкод:2015OExpr..23.7734A. дои:10.1364 / oe.23.007734. PMC  5802244. PMID  25837112.
  8. ^ Рам, Срипад; Прабхат, Прашант; Чао, Джерри; Салли Уорд, Э .; Обер, Раймунд Дж. (2008). «Тірі жасушалардағы жылдам жасушаішілік динамиканы зерттеу үшін мультифокальды жазықтық микроскопиясымен үш өлшемді кванттық нүктелерді қадағалау». Биофизикалық журнал. 95 (12): 6025–6043. Бибкод:2008BpJ .... 95.6025R. дои:10.1529 / biophysj.108.140392. PMC  2599831. PMID  18835896.
  9. ^ Далгарно, П.А .; Далгарно, H. I. C .; Путуд, А .; Ламберт, Р .; Патерсон, Л .; Логан, Д.С .; Тауэрс, Д.П .; Уорбертон, Р. Дж .; Greenaway, A. H. (2010). «Биопрепаратты бейнелеу және биологиялық микроскопиядағы үш өлшемді наноөлшемді бақылау» (PDF). Optics Express. 18 (2): 877–884. Бибкод:2010OExpr..18..877D. дои:10.1364 / OE.18.000877. PMID  20173908. S2CID  7701295.
  10. ^ «MUM - Обер зертханасы». UT Оңтүстік-Батыс. Алынған 19 шілде 2012.
  11. ^ Прабхат, П .; Ган, З .; Чао, Дж .; Рам, С .; Ваккаро, С .; Гиббонс, С .; Обер, Р. Дж .; Ward, E. S. (2007). «FcRc рецепторының экзоцитозына апаратын жасушаішілік қайта өңдеу жолдарын мультифокалды жазықтық микроскопиясын қолдану арқылы түсіндіру». Ұлттық ғылым академиясының материалдары. 104 (14): 5889–5894. Бибкод:2007PNAS..104.5889P. дои:10.1073 / pnas.0700337104. PMC  1851587. PMID  17384151.
  12. ^ Рам, С .; Уорд, Е.С .; Обер, Р.Ж. (2005). Николау, Дэн V; Эндерлейн, Джоерг; Лейф, Роберт С; Фаркас, Даниэль Л; Рагхавачари, Рамеш (ред.) «Флуоресценттік микроскоптың көмегімен бір молекуланы үш өлшемде қаншалықты дәл локализациялауға болады?». SPIE туралы материалдар. Биомолекулалар мен жасушаларды кескіндеу, манипуляциялау және талдау: негіздері және қолданылуы III. 5699: 426–435. дои:10.1117/12.587878. PMC  2864488. PMID  20448826.
  13. ^ «Екі қабатты FPALM микроскопы».
  14. ^ Рам, Срипад; Чао, Джерри; Прабхат, Прашант; Уорд, Э. Сэлли; Обер, Раймунд Дж. (2007). Кончелло, Хосе-Анхель; Когсвелл, Кэрол Дж; Уилсон, Тони (ред.) «Микроскопиялық объектілердің үш өлшемді орналасуын қосымшалармен өлшеуді анықтауға жаңа тәсіл». SPIE туралы материалдар. Үшөлшемді және көпөлшемді микроскопия: кескін алу және өңдеу XIV. 6443: 6443–0C. дои:10.1117/12.698763. S2CID  121283489.
  15. ^ Рам, Срипад; Прабхат, Прашант; Уорд, Э. Сэлли; Обер, Раймунд Дж. (2009). «Қос объективті көпфокалды жазықтық микроскопиясымен бір бөлшектерді оқшаулау дәлдігі жақсартылды». Optics Express. 17 (8): 6881–6898. Бибкод:2009OExpr..17.6881R. дои:10.1364 / OE.17.006881. PMC  2720637. PMID  19365515.

Сыртқы сілтемелер