Кітапхана (биология) - Library (biology)

Учаскенің қанығуының мутагенезі түрі болып табылады сайтқа бағытталған мутагенез. Бұл сурет теориялық 10 қалдықты ақуыздағы бір позицияның қаныққан мутагенезін көрсетеді. Ақуыздың жабайы типтегі нұсқасы жоғарғы жағында көрсетілген, ал бірінші метионин амин қышқылын білдіретін М, ал * аударудың аяқталуын білдіреді. 5 позициядағы изолейциннің барлық 19 мутанттары төменде көрсетілген.

ДНҚ кітапханалары қалай жасалады кездейсоқ мутагенез реттік кеңістіктің үлгісі. Берілген күйге ауыстырылған амин қышқылы көрсетілген. Әрбір нүкте немесе қосылған нүктелер жиынтығы кітапхананың бір мүшесі болып табылады. Қатеге бейім ПТР басқа аминқышқылдардың кейбір қалдықтарын кездейсоқ мутацияға ұшыратады. Аланинді сканерлеу ақуыздың әрбір тіршілігін аланинмен бір-бірлеп алмастырады. Учаскенің қанықтылығы 20 мүмкін аминқышқылдарының әрқайсысын (немесе олардың кейбір жиынтығын) бір позицияда бір-бірден алмастырады.

Жылы молекулалық биология, а кітапхана процесі арқылы микроорганизмдер популяциясында сақталатын және көбейетін ДНҚ фрагменттерінің жиынтығы молекулалық клондау. ДНҚ кітапханаларының әр түрлі типтері бар, соның ішінде cDNA кітапханалары (бастап қалыптасқан кері транскрипцияланған РНҚ ), геномдық кітапханалар (геномдық ДНҚ-дан пайда болған) және рандомизацияланған мутантты кітапханалар (аль-баламалы нуклеотидтер немесе кодондар енгізілген де-ново гендерінің синтезі арқылы жасалады). ДНҚ кітапханасының технологиясы - ағымның негізгі тірегі молекулалық биология, генетикалық инженерия, және ақуыздық инженерия және бұл кітапханалардың қолданылуы ДНҚ фрагменттерінің бастапқы көзіне байланысты. Айырмашылықтар бар клондау векторлары және кітапхананы дайындауда қолданылатын әдістер, бірақ жалпы ДНҚ-ның әрбір фрагменті клондау векторына ерекше енгізіліп, рекомбинантты ДНҚ молекулаларының бассейні популяцияға ауысады. бактериялар (а Бактериялардың жасанды хромосомасы немесе BAC кітапханасы) немесе әр организмде орта есеппен бір конструкция болатындай етіп ашытқы (вектор + кірістіру). Ағзалардың популяциясы мәдениетте өсетін болғандықтан, олардың құрамындағы ДНҚ молекулалары көшіріліп, көбейтіледі (осылайша «клондалған»).

Терминология

«Кітапхана» термині организмдердің популяциясын білдіруі мүмкін, олардың әрқайсысы клондау векторына енгізілген ДНҚ молекуласын немесе басқа клондалған вектор молекулаларының жиынтығын алып жүреді.

cDNA кітапханалары

A cDNA кітапханасы үлгісін білдіреді мРНҚ белгілі бір көзден (не жасушалар жиынтығы, белгілі бір тін немесе бүкіл организм) тазартылған, ол ферментті қолдану арқылы қайтадан ДНҚ шаблонына айналған кері транскриптаза. Осылайша, мРНҚ тазарған кезде болған физиологиялық, дамудың немесе қоршаған орта жағдайында сол нақты қайнар көзге белсенді транскрипцияланған гендерді білдіреді. cDNA кітапханаларын «толық ұзындықтағы» клондарды насихаттайтын әдістерді пайдалана отырып немесе «анықтау үшін пайдаланылатын қысқа фрагменттерді тудыратын жағдайда жасауға болады»көрсетілген реттік тегтер ".

cDNA кітапханалары кері генетикада пайдалы, бірақ олар белгілі бір организмдегі жалпы геномның өте аз (1% -дан аз) бөлігін ғана көрсетеді.

CDNA кітапханаларының қосымшаларына мыналар жатады:

Роман гендерінің ашылуы
Толық ұзындықтағы кДНҚ молекулаларын клондау in vitro гендердің қызметін зерттеу
Әр түрлі жасушаларда немесе тіндерде көрсетілген мРНҚ репертуарын зерттеу
Оқу балама қосу әртүрлі жасушаларда немесе тіндерде

Геномдық кітапханалар

A геномдық кітапхана бұл берілген организмнің бүкіл геномын бейнелейтін клондар жиынтығы. Геномдық кітапхананы құрайтын клондардың саны (1) қарастырылып отырған геномның мөлшеріне және (2) кірістіру өлшеміне байланысты. клондау векторы жүйе. Көптеген практикалық мақсаттар үшін геномдық ДНҚ-ның тіндік көзі маңызды емес, өйткені дененің әрбір жасушасында іс жүзінде бірдей ДНҚ бар (кейбір ерекшеліктерді қоспағанда).

Геномдық кітапханалардың қосымшаларына мыналар жатады:

Берілген организмнің толық геномдық реттілігін анықтау (қараңыз) геномдық жоба )
Генерациялау үшін геномдық реттіліктің көзі ретінде қызмет етеді трансгенді жануарлар арқылы генетикалық инженерия
Функциясын зерттеу реттеу реттілігі in vitro
Оқу генетикалық мутациялар жылы қатерлі ісік тіндер

Синтетикалық мутантты кітапханалар

Учаскеге бағытталған мутагенез кітапханасын клондаудың бір кең таралған әдісін бейнелеу (яғни деградацияланған олигостарды қолдану). Қызығушылықтың гені құрамында шаблоны (көк), және шаблоннан бір немесе бірнеше нуклеотидтермен (қызыл) ерекшеленетін аймақ бар олигос бар ПЦР. Комплементсіз аймақта деградациясы бар көптеген осындай праймерлер бір ПТР-ға біріктіріледі, нәтижесінде сол аймақта әртүрлі мутацияларға ие көптеген ПТР өнімдері пайда болады (жеке мутанттар төменде әртүрлі түстермен көрсетілген).

Жоғарыда сипатталған кітапхана түрлерінен айырмашылығы, вариантты гендердің кітапханаларын жасау үшін әртүрлі жасанды әдістер бар.^[1] Ген бойындағы вариация кез-келген түрде кездейсоқ енгізілуі мүмкін қате туындататын ПТР,^[2] ДНҚ-ны араластыру ұқсас гендердің бөліктерін біріктіру үшін,^[3] немесе транспозонға негізделген әдістерді енгізу индельдер.^[4]Сонымен қатар, мутациялар кезінде арнайы кодондарға бағытталуы мүмкін де ново синтез немесе қанығу мутагенезі бір немесе бірнеше салу мутанттар бақыланатын жолмен геннің^[5] Нәтижесінде бастапқы геннің нұсқаларын ұсынатын екі тізбекті ДНҚ молекулаларының қоспасы пайда болады.

The білдірді содан кейін осы кітапханалардан алынған ақуыздарды қолайлы қасиеттері бар нұсқалар бойынша тексеруге болады (мысалы, тұрақтылық, байланыстырушы жақындығы немесе фермент белсенділігі). Мұны гендік нұсқаларды құру циклында және а-да экспрессиялық өнімді скринингте қайталауға болады бағытталған эволюция процесс.^[1]

CDNA кітапханасын дайындау техникасына шолу

ДНҚ экстракциясы

Егер mRNA кітапханасын құратын болсақ (яғни cDNA клондарымен), толық ұзындықтағы mRNA оқшаулауының бірнеше хаттамалары бар. ДНҚ-ны геномдық ДНҚ-ға (гДНҚ деп те аталады) бөліп алу үшін ДНҚ мини-препарат пайдалы болуы мүмкін.

Кірістерді дайындаңыз

cDNA кітапханалары мРНҚ-ның толық ұзындықтағы клондарының кДНҚ ретінде алынуын қамтамасыз ету үшін мұқият болуды қажет етеді (ол кейінірек векторларға енгізіледі). Осы себепті 1-ші кДНҚ тізбегі мен 2-ші кДНҚ тізбегінің синтезін оңтайландыруға және сонымен қатар векторға бағытталған клондауды жасауға бірнеше хаттамалар жасалған.

Экстракцияланған гДНҚ-дан гДНҚ фрагменттері спецификалық емес жиі кескішті рестрикциялау ферменттерін қолдану арқылы түзіледі.

Векторлар

Қызығушылық туғызатын нуклеотидтер тізбегі а-ға кірістіру ретінде сақталады плазмида немесе а. геномы бактериофаг бактериялық жасушаларды жұқтыру үшін қолданылған.

Векторлар көбінесе бактериалды жасушаларда таралады, бірақ егер YAC (ашытқы жасанды хромосомасы) қолданылса, онда ашытқы жасушаларын қолдануға болады. Векторларды вируста да көбейтуге болады, бірақ бұл көп уақытты қажет етеді және жалықтырады. Алайда вирустарды (көбінесе фагтарды) қолдану арқылы алынған трансфекцияның жоғары тиімділігі оларды векторды орау үшін (байланыстырылған кірістірумен), содан кейін оларды бактериялық (немесе ашытқы) жасушаға енгізу үшін пайдалы етеді.

Сонымен қатар, cDNA кітапханалары үшін Lambda Zap II фагы, ExAssist және 2 E. coli түрлерін қолданатын жүйе жасалған. Оның орнына loxP тораптарын қолданатын Cre-Lox жүйесін және рекомбиназа ферментінің in vivo экспрессиясын қолдануға болады. Бұл in vivo экзизия жүйелерінің мысалдары. Іn vitro экскизия көбінесе дәстүрлі рестрикция ферменттері мен клондау стратегияларын қолданып субклондауды қамтиды. In vitro экскизия көп уақытты қажет етуі мүмкін және in vivo экзизия жүйелеріне қарағанда көбірек «практикалық» жұмысты қажет етуі мүмкін. Кез-келген жағдайда, жүйелер вектордың фагтан тірі ұяшыққа қозғалуына мүмкіндік береді, мұнда вектор кітапхананы қолданғанға дейін көбейіп, тарала алады.

Кітапханаларды пайдалану

Қызығушылық тудыратын химиялық зат жасушаларын анықтау үшін синтетикалық кітапхананы скринингтеуге арналған жұмыс процесі.

Бұл қызығушылық дәйектіліктеріне арналған «скринингті» қамтиды. Бұған жетудің бірнеше әдісі бар.

Әдебиеттер тізімі

^ ^а ^б Ваджапи, Нарендра; Лю, Алекс Ю.; Форлони, Маттео (2018-03-01). «Қате ДНҚ полимеразаларын қолдану арқылы кездейсоқ мутагенез». Суық көктем айлағының хаттамалары. 2018 (3): pdb.prot097741. дои:10.1101 / pdb.prot097741. ISSN 1940-3402. PMID 29496818.
^ МакКаллум, Элизабет О .; Уильямс, Берия А. Чжан, Цзинглей; Чапут, Джон С. (2010), Браман, Джефф (ред.), «Кездейсоқ Мутагенезия қатеге бейім ПТР», In Vitro Мутагенез хаттамалары: үшінші басылым, Молекулалық биологиядағы әдістер, Humana Press, 634, 103-109 б., дои:10.1007/978-1-60761-652-8_7, ISBN 9781607616528, PMID 20676978
^ Crameri A, Raillard SA, Bermudez E, Stemmer WP (қаңтар 1998). «Әр түрлі гендер тұқымдасының ДНҚ-ны араластыруы бағытталған эволюцияны жеделдетеді». Табиғат. 391 (6664): 288–91. Бибкод:1998 ж.391..288С. дои:10.1038/34663. PMID 9440693.
^ Джонс ДД (мамыр 2005). «Үштік нуклеотидті мақсатты гендегі кездейсоқ қалыпта жою: амин қышқылының жойылуына ТЕМ-1 бета-лактамазаның төзімділігі». Нуклеин қышқылдарын зерттеу. 33 (9): e80. дои:10.1093 / nar / gni077. PMC 1129029. PMID 15897323.
^ Ван, Тянь-Вэнь; Чжу, Ху; Ма, Син-Юань; Чжан, Тинг; Ма, Ю-Шу; Вэй, Дун-Чжи (2006-09-01). «Бағытталған молекулалық эволюциядағы мутантты кітапхана құрылысы». Молекулалық биотехнология. 34 (1): 55–68. дои:10.1385 / MB: 34: 1: 55. ISSN 1559-0305. PMID 16943572.

Сыртқы сілтемелер

[:0-1] а ^б Ваджапи, Нарендра; Лю, Алекс Ю.; Форлони, Маттео (2018-03-01). «Қате ДНҚ полимеразаларын қолдану арқылы кездейсоқ мутагенез». Суық көктем айлағының хаттамалары. 2018 (3): pdb.prot097741. дои:10.1101 / pdb.prot097741. ISSN 1940-3402. PMID 29496818.

[2] МакКаллум, Элизабет О .; Уильямс, Берия А. Чжан, Цзинглей; Чапут, Джон С. (2010), Браман, Джефф (ред.), «Кездейсоқ Мутагенезия қатеге бейім ПТР», In Vitro Мутагенез хаттамалары: үшінші басылым, Молекулалық биологиядағы әдістер, Humana Press, 634, 103-109 б., дои:10.1007/978-1-60761-652-8_7, ISBN 9781607616528, PMID 20676978

[3] Crameri A, Raillard SA, Bermudez E, Stemmer WP (қаңтар 1998). «Әр түрлі гендер тұқымдасының ДНҚ-ны араластыруы бағытталған эволюцияны жеделдетеді». Табиғат. 391 (6664): 288–91. Бибкод:1998 ж.391..288С. дои:10.1038/34663. PMID 9440693.

[4] Джонс ДД (мамыр 2005). «Үштік нуклеотидті мақсатты гендегі кездейсоқ қалыпта жою: амин қышқылының жойылуына ТЕМ-1 бета-лактамазаның төзімділігі». Нуклеин қышқылдарын зерттеу. 33 (9): e80. дои:10.1093 / nar / gni077. PMC 1129029. PMID 15897323.

[5] Ван, Тянь-Вэнь; Чжу, Ху; Ма, Син-Юань; Чжан, Тинг; Ма, Ю-Шу; Вэй, Дун-Чжи (2006-09-01). «Бағытталған молекулалық эволюциядағы мутантты кітапхана құрылысы». Молекулалық биотехнология. 34 (1): 55–68. дои:10.1385 / MB: 34: 1: 55. ISSN 1559-0305. PMID 16943572.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]