Eos (ақуыз) - Eos (protein)

EosFP Бұл фотоактивті жасылдан қызылға дейін флуоресцентті ақуыз. Оның жасыл флуоресценциясы (516 нм) қызылға (581 нм) ауысады Ультрафиолет сәулеленуі ~ 390 нм (күлгін / көк жарық) фотопластинкалық модификацияға байланысты, пептид омыртқасының сынуы нәтижесінде хромофор.[1] Eos алғаш рет а ретінде ашылды тетрамерлі ақуыз тас маржанда Lobophyllia hemprichii[2]. Басқа люминесцентті ақуыздар сияқты, Eos қосылуға ақуыздарды қадағалау, көп түсті таңбалау және жасушалардың қозғалысын қадағалау сияқты қосымшаларға мүмкіндік береді.[3] Eos-тің бірнеше нұсқалары mEos2, mEos4 және CaMPARI, соның ішінде арнайы зерттеу жүйелерінде қолдану үшін жасалған.

Тарих

Тас маржан, Lobophyllia hemprichii, одан EosFP табылды.

EosFP алғаш рет 2005 жылы үлкен масштабтағы экран кезінде табылды PAFPs тасты маржан ішіндегі (фотоактивті флуоресцентті белоктар) Lobophyllia hemprichii.[2] Содан бері ол сәтті клондалды Ішек таяқшасы және біріктіру конструкциялары адам жасушаларында қолдануға арналған.[2] Eos атымен аталды Грек таңы құдайы.[2]

Алынған тетрамерлі флуоресцентті белоктардан айырмашылығы антозоан ақуыз суббірліктерінің өзара әрекеттесуіне байланысты жасушаның қалыпты жұмысына кедергі келтіруі мүмкін маржан, EosFP dimeric және мономерлі бір нүктені енгізу арқылы нұсқалар мутациялар.[4] Бұл нұсқалар жасушалық компоненттерді қадағалауда табысты болды, олар негізгі клеткадағы алаңдатқыш функциясынсыз және жабайы типтегі Eos сияқты фотофизикалық қасиеттерді сақтайды.[5]

Момерлі Eos зондтары (mEos) олардың ашылуынан бастап локализацияланған цитозол, плазмалық мембрана, эндосомалар, превакулярлы көпіршіктер, вакуольдер, эндоплазмалық тор, голги денелері, пероксисомалар, митохондрия, инвагинация, жіп тәрізді актин және кортикальды микротүтікшелер.[6] mEos термоядролық ақуыздары бір жасушаларда немесе дамып келе жатқан мүшелердегі жасушалар тобында түрлі-түсті таңбалауға мүмкіндік береді. Оларды органеллалар мен көпіршіктер арасындағы кеңістіктік / уақыттық өзара әрекеттесуді түсіну үшін де қолдануға болады. MEosFP-нің екі флуоресцентті формасы (жасыл және қызыл) көп түсті таңбалау үшін CFP, GFP, YFP және RFP-мен үйлеседі.[6]

Функция

EosFP 390 нм ультрафиолет сәулесімен сәулеленген кезде қызылға (581 нм) қайтымсыз өзгеретін күшті жасыл флуоресценция шығарады (516 нм). Бұл модификация хромофораның жанындағы пептидтік омыртқаның үзілуіне байланысты пайда болады.[2] Бұл механизм ақуыздың локализацияланған тегтелуіне мүмкіндік береді және EosFP-ді тірі жасушалар ішіндегі ақуыздардың қозғалысын бақылауға арналған құрал етеді.[7] Қызыл хромофордың пайда болуы пептидтік омыртқаны бөлшектеуді қамтиды, бірақ ақуыз құрылымында басқа өзгерістер жоқ.[8]

Бір молекула бойынша флуоресценттік спектроскопия , EosFP бұл тетрамерикалық және экспонаттар мықты Форстер резонансы жекелеген фторофорлар шеңберіндегі муфталар.[2] Басқа люминесцентті ақуыздар сияқты, Eos-да әртүрлі сигналдар туралы хабарлауға болады жасушалар, тіндер және органдар күрделі биологиялық техниканы алаңдатпай. Флуоресцентті ақуыздарды пайдалану бір кездері жасыл флуоресцентті ақуызмен шектелген (GFP ), соңғы жылдары көптеген басқа флуоресцентті ақуыздар клондалды. Люминесцентті медузадан алынған ГФП-ден айырмашылығы Aequorea victoria, алынған флуоресцентті ақуыздар антозоа, соның ішінде Eos, қызыл спектрлік диапазонда флуоресценция шығарады. Eos-тағы фотосуреттерден алынған жасыл-қызыл конверсияның жаңа қасиеті пайдалы, себебі ол тірі жасушалардағы белоктарды бақылауға мүмкіндік береді.[2] EosFP бірегей болып табылады, өйткені ол толқын ұзындығында үлкен бөлгіштікке ие, бұл шыңдарды анықтауға мүмкіндік береді.[5] Барлық жасылдан қызылға дейін фотоиндуцентті люминесцентті ақуыздар, соның ішінде Eos құрамында трипептид оның-тир-глиінен алынған хромофоралық бірлік бар. Бұл жасылдан қызылға ауысу басқа FP-дегідей химиялық тотығудан гөрі жарықпен аяқталады.[5]

Құрылымы және сіңіру қасиеттері

EosFP өзінің жасыл түрінде.
Алынған жасыл фосфорлы-флуоресцентті EosFP көрінісі (~ 516м) Ақуыздар туралы мәліметтер банкі (PDB) арқылы Рентгендік дифракция.

Бастапқы құрылым

EosFP 226-дан тұрады аминқышқылдары. Оның молекулалық массасы 25,8 кДа, ал pl - 6,9. Eos-да 84% бірдей қалдықтар бар Каеде, басқа склерактиналық кораллдан шыққан люминесцентті ақуыз Трахифилия геофройы, сонымен қатар ультрафиолет сәулесінің көмегімен жасылдан қызыл сәулеге айналдыруға болады.[8] Phe-61 және His-62 қалдықтарын қоспағанда, фотохимиялық модификация хромофор ортасына және хромофордың өзіне әсер етпейді.[7] Жабайы типтегі EosFP суббірліктердің тетрамерикалық орналасуына ие, мұнда әр суббірлік GFP сияқты β-құрылымға ие. Бұл құрылымға 11 иірімді баррель және орталық осьтен төмен фторофор бар спираль кіреді.

Green EosFP құрылымы

Аниондық түрінде жасыл хромофор 506 нм-де сіңіру максимумына және 516 нм-де эмиссиялық максимумға ие. Ол авто-каталитикалық жолмен His-62, Tyr-63 және Gly-64 амин қышқылдарынан түзіледі. Хромофордың айналасында бірден зарядталған немесе полярлы амин қышқылдарының шоғыры, сонымен қатар құрылымдық су молекулалары бар. Хромофор жазықтығының үстінде Глу-144, Хис-194, Глу-212 және Глн-38 арасындағы сутектік байланыстардың өзара әрекеттесу желісі орналасқан. Arg-66 және Arg-91 жасыл Eos имидазолинон бөлігінің карбонилді оттегімен сутегімен байланысуға қатысады. His-62 бүйір тізбегі полярсыз ортада жатыр.[7] Жасылдан қызыл түрге ауысу хромофорды құрайтын трипептидті HYG трипептидінің бірінші позициясында гистидиннің болуына байланысты. Бұл гистидин қалдықтары M, S, T немесе L-мен алмастырылған кезде, Eos тек ашық жасыл жарық шығарады және бұдан әрі фотоконверсиялық люминесцентті ақуыз ретінде әрекет етпейді.[2]

EosFP қызыл формасы
Фотослуоресцентті EosFP-тің қызыл түрінде (~ 581) ұсынылуы Ақуыздар туралы мәліметтер банкі (PDB) арқылы Рентгендік дифракция.

Red EosFP құрылымы

Пептидтік омыртқаның бөлінуінен пайда болатын қызыл хромофордың аниондық түрінде сіңіру максимумы 571 нм-де және шығарылым максимумы 581 нм-де болады. Осы хромофорға әкелетін пептидтік омыртқаның үзілуі His-62 Nα мен Cα арасында болады.[5] Қызыл флуоресценция Хис-62 имидазол сақинасы имидазолинонға қосылатын жерде хромофораның π-конъюгациясының кеңеюіне байланысты болады. Қызыл және жасыл хромофорлардың сутектік байланысының заңдылықтары бірдей.[7]

Қасиеттері[9]
Фотоконверсиялық толқын ұзындығы390 нм
Жасыл сіңіргіштік шыңы506 нм
Жасыл сәуле шығарудың шыңы516 нм
Қызыл сіңіру шыңы571 нм
Қызыл эмиссияның шыңы581 нм
Жасыл жарықтық *1.3X
Қызыл жарықтық *0.7X
*Жарықтық мәндері қатысты EGFP.

Фотохимиялық конверсия

Фотохимиялық конверсия хромофоралық бірлік пен оның маңындағы қалдықтардың өзара әрекеттесуіне байланысты жүреді. Glu-212 а-ны жоятын негіз ретінде жұмыс істейді протон His-62-ден His-62-Nα-Cα байланысының бөлінуіне көмектеседі. Glu-212-ді глутаминмен ауыстыру фотоконверсияны болдырмайды. РН төмен болған кезде протондалған түрдегі молекулалардың үлесі көбейген сайын фотоконверсияға қатысатын Eos өнімділігі айтарлықтай артады. Фотоконверсияның әсер ету спектрі Eos протонды формасының әрекет спектрімен тығыз байланысты. Бұл бақылаулар жасыл хромофордың бейтарап формасы, оның ішінде протондалған Tyr-63 бүйір тізбегін фотоконверсияға арналған шлюз құрылымы деп болжайды. Тир-63 фенил бүйірлік тізбегінен протонды шығару - бұл протеин Хис-62 имидазолынан сутегі-Phe-61 карбонилімен байланысқан ауысатын конверсия механизміндегі маңызды оқиға. Қосымша протон Хис-62-ді протеинді Фе-61 карбониліне шығарады, оны жою реакциясы кезінде Хис пен Фе арасындағы пептидтік байланыстан шығатын топ түзеді. Хис-62 бүйір тізбегі фото қозу кезінде протонды болады және кететін топтағы Фе-61 карбониліне протон беру арқылы реакцияға көмектеседі. Магистраль бөлінгеннен кейін Хис-62 мен Фе-61 арасындағы сутектік байланыс қайта құрылады. His-62 басқа амин қышқылдарымен алмастырылған кезде, EosFP фотоконверсия қабілетін жоғалтады, бұл His-62 фотоконверсия механизмінің қажетті компоненті болып табылады.[7] Жасыл хромофордың зарядтың ішкі таралуы элиминация реакциясына көмектесу үшін фото қозу кезінде өзгереді.[5]

Спектроскопия

Екі флуоресценция қозу және эмиссия жабайы типтегі EosFP спектрлері қоздыру кезінде спектрдің қызыл соңына қарай ~ 65 нм оңға ығысады. Бұл спектрлік өзгеріс хромофораның созылуынан, қайтымсыз механизмде Phe-61 мен His-62 арасындағы пептидтік омыртқаның үзілуімен жүреді.[1] 432 нм-де айқын изосбестикалық нүктенің болуы екі түрдің өзара конверсиясын ұсынады. Сіңіру шыңы 280 нм-де көрінеді хош иісті аминқышқылдары олар қозу энергиясын жасыл хромофорға ауыстырады. The кванттық кірістілік жасыл шығаратын Eos формасының 0,7 құрайды.[2] Қызыл ығысқан түрлерде қоздыру спектрінде және шығарылым спектрінде сәйкесінше 533 нм және 629 нм негізгі шыңнан бөлек айқын виброндық бүйірлік белдеулер бар. Қызыл фторофордың FRET қозуына байланысты қызыл қоздыру спектрінде тағы 502 нм шыңы бар.[1] Қызыл шығаратын форманың кванттық шығымы 0,55 құрайды.[2]

EosFP нұсқалары спектроскопиялық қасиеттерде ешқандай айырмашылықты көрсетпейді, сондықтан интерфейстердің бөлінуінен туындайтын құрылымдық модификацияның фтороформен байланысатын учаске құрылымына әсері аз болуы мүмкін.[4]

Қолданбалар

Біріктірілген ақуыздарды қадағалау

EosFP және оның құрастырылған нұсқаларын қолдана отырып, көптеген әртүрлі синтезделген ақуыздар құрылды. Бұл біріктіру ақуыздары белоктар мен протеин-ДНК өзара әрекеттесуі сияқты күрделі биологиялық функцияларды сақтай отырып, тірі жасушалардағы ақуыздарды бақылауға мүмкіндік береді. Eos термоядролық конструкцияларына мыналар жатады рекомбинациялық байланыстырушы ақуыз (RBP) және цитокератин.[2] Зерттеулер көрсеткендей, ақуызды қызығушылықпен байланыстыру тиімді N-терминал EosFP жапсырмасының жағы.[3] Бұл біріктіру конструкциялары ядролық транслокацияны визуалдау үшін қолданылған андрогенді рецепторлар динамикасы цитоскелет бірге актин және винкулин және RBP-мен ядролық ақуыздың қозғалысы.[3]

Көп түсті таңбалау

EosFP синтездеу конструкцияларында қызығушылық тудыратын ақуыздың функционалдығын сақтай отырып қолдануға болатындықтан, бұл көп түсті таңбалауды зерттеу үшін танымал таңдау болып табылады.[3] Кезеңдерін картаға түсіру үшін екі түсті таңбалау экспериментінде митоз, HEK293 жасушалар алдымен тубулинмен байланысатын ақуызбен тұрақты түрде трансфекцияланды кДНҚ біріктірілген EGFP бейнелеу үшін шпиндель аппараты. Содан кейін митоздың басталуын елестету үшін d2EosFP-мен біріктірілген рекомбинациялық сигналды байланыстыратын ақуыздың (RBP) өтпелі трансфекциясы қолданылды. Фотоконверсия флуоресцентті микроскопиямен аяқталды және екі жиынтықтың аражігін көрсетті хромосомалар кезінде анафаза, телофаза және цитокинез.[4]

Даму биологиясындағы жасушалардың қозғалысын қадағалау

EosFP эмбрионалды даму кезінде жасушалардың қозғалысын бақылау үшін қолданылған Xenopus laevis. Екі жасушалы / ерте гаструла сатысында димерлі EosFP (d2EosFP) үшін кодталған мРНҚ кодтау жасушаларға енгізіліп, люминесценттік микроскопия көмегімен жергілікті фотоконверсияланған.[3] Бұл флуоресцентті эмбриондар нейруляция кезінде жасушалардың қозғалу динамикасын көрсетті. EosFP бөлігі табылды ночорд бұл EosFP-ді қолдану мүмкіндігін көрсетеді тағдырды бейнелеу тәжірибелер.[4]

Инженерлік нұсқалар

mEos4

EosFP-нің көптеген жаңа мономерлік нұсқалары жасалды, олар EosFP жабайы типіне қарағанда артықшылықтар ұсынады. Ховард Хьюз Медицина Институты жанындағы Жанелия фермасының ғылыми қалашығындағы топ жасаған mEos4 фотосурет қабілеттілігі және бейнелеу қабілеті EosFP-ге қарағанда жоғары. Ол сондай-ақ PFA, глютеральдегид және OsO4 үлгілерді сақтау үшін қолданылады. mEos4 EosFP-ге қарағанда жоғары температурада тиімді, фот жылдамдықпен өзгереді және жасыл және қызыл флуоресцентті күйлерде эмиссиялық амплитудасы жоғары болады. MEos4 ақуызына қосымшаларға фотоактивация оқшаулауының микроскопиясы (PALM), корреляциялық жарық / электронды микроскопия (CLEM), ақуыз белсенділігінің көрсеткіші және белсенділік интеграциясы жатады (уақыт бойынша ақуыздың белсенділігі үшін пост-хоч бейнесі).[10]

mEos2

mEosFP - бұл 37 градус Цельсийде тиімді бүктелетін тағы бір мономерлік Eos нұсқасы. Мұнда tdEos (тандем димері) сияқты нысандарды біріктіре алмайды гистондар, тубулин, аралық жіптер және аралық түйісулер және mEos (мономерлі), ол тек 30 градус Цельсийде сәтті қолданыла алады, mEos2 - бұл 37 градус Цельсия бойынша тиімді бүктелетін және басқа флуоресцентті ақуыз димерлерінің бірігуіне төзімсіз нысандарды сәтті таңдай алатын инженерлік нұсқа. mEos2 шамамен бірдей спектрлік қасиеттерді, жарықтықты, pKa, фотоконверсия, контраст және WT Eos жетілу қасиеттерін көрсетеді. MEos2 локализациясының дәлдігі басқа мономерлі флуоресцентті ақуыздарға қарағанда екі есе үлкен.[10]

CaMPARI

Сондай-ақ, Жанелия ғылыми кампусында CaMPARI (кальциймен модуляцияланған фотоактивтелетін ратиометриялық интегратор) деп аталатын жаңа флуоресцентті молекулалар жасалды.[11] Тұрақты жасылдан қызылға айналу сигналы кальцийге сезімтал ақуызмен қосылды, кальмодулин, сондықтан синтез құрылымындағы түс өзгеруі кальцийдің бөлінуіне байланысты жүйке белсенділік. CaMPARI тұрақты түрде белгілей алады нейрондар олар кез-келген уақытта белсенді болады, сонымен қатар оларға бағытталуы мүмкін синапстар.[12] Бұл визуалды көрініс микроскопты қолданудың шектеулі көрінісіне қарағанда мидың тіндерінің кең көлемінде болуы мүмкін. Сондай-ақ, бұл күрделі мінез-құлық кезінде жүйке белсенділігін визуализациялауға мүмкіндік береді, өйткені зерттелетін организм микроскоппен емес, еркін қозғалады. Бұл сонымен қатар белгілі бір мінез-құлық кезеңдерінде нейрондарды байқауға мүмкіндік береді. CaMPARI осы уақытқа дейін белсенді жүйке тізбектерін белгілеу үшін қолданылған тышқандар, зебрбиш және жеміс шыбыны.[13]

Әдебиеттер тізімі

  1. ^ а б c Иванченко, Сергей; Роккер, Карлхейнц; Освальд, Франц; Виденманн, Йорг; Nienhaus, G. Ulrich (2005). «Флуоресцентті маркер ақуызы - EosFP-нің мақсатты жасыл-қызыл фотоконверсиясы». Биологиялық физика журналы. 31 (3–4): 249–259. дои:10.1007 / s10867-005-0174-z. ISSN  0092-0606. PMC  3456337. PMID  23345897.
  2. ^ а б c г. e f ж сағ мен j к Виденманн, Йорг; Иванченко, Сергей; Освальд, Франц; Шмитт, Флориан; Роккер, Карлхейнц; Салих, Аня; Шпиндлер, Клаус-Дитер; Nienhaus, G. Ulrich (2004-11-09). «EosFP, флуоресцентті флюоресценцияның ультрафиолет индукциясы бар жасыл-қызыл флуоресценциясы бар флуоресцентті маркер ақуызы». Америка Құрама Штаттарының Ұлттық Ғылым Академиясының еңбектері. 101 (45): 15905–15910. Бибкод:2004PNAS..10115905W. дои:10.1073 / pnas.0403668101. ISSN  0027-8424. PMC  528746. PMID  15505211.
  3. ^ а б c г. e Виденман, Йорг; Nienhaus, G Ulrich (2006). «EosFP және GFP отбасының басқа фотоактивтелетін маркер протеиндерімен жасушалық бейнелеу». Протеомиканың сараптамалық шолуы. 3 (3): 361–374. дои:10.1586/14789450.3.3.361. PMID  16771707.
  4. ^ а б c г. Ниенгауз, Г.Ульрих; Ниенгауз, Карин; Хельз, Анжела; Иванченко, Сергей; Ренци, Фабиана; Освальд, Франц; Вулф, Майкл; Шмитт, Флориан; Роккер, Карлхейнц (2006). «EosFP фотоконверсиялы флуоресцентті протеин: биофизикалық қасиеттері және жасуша биологиясының қосымшалары». Фотохимия және фотобиология. 82 (2): 351–8. дои:10.1562 / 2005-05-19-ra-533. PMID  16613485.
  5. ^ а б c г. e Мизуно, Хидеаки; Мал, Тапас Кумар; Тонг, I жинақ.; Андо, Риоко; Фурута, Тосиаки; Икура, Мицухико; Мияваки, Атсуши (2003-10-01). «Флуоресцентті ақуыздың жасылдан қызылға ауысуындағы фотопластиналық пептидті бөлшектеу». Молекулалық жасуша. 12 (4): 1051–1058. дои:10.1016 / S1097-2765 (03) 00393-9. PMID  14580354.
  6. ^ а б Матхур, Джайдип; Радхамони, Ресми; Синклер, Элисон М .; Доносо, Ана; Данн, Натали; Роуч, Елисе; Рэдфорд, Девон; Мохагег, П.С.Мохаммад; Логан, Дэвид С. (2010-12-01). «mEosFP негізіндегі жасылдан қызылға дейінгі фотоконверсиялық өсімдіктерге арналған жасушалық зондтар». Өсімдіктер физиологиясы. 154 (4): 1573–1587. дои:10.1104 / б.110.165431. ISSN  0032-0889. PMC  2996014. PMID  20940350.
  7. ^ а б c г. e Ниенгауз, Карин; Ниенгауз, Г.Ульрих; Виденманн, Йорг; Нар, Герберт (2005-06-28). «Фотосуретпен ақуыздың бөлінуіне және флуоресцентті протеин EosFP-нің жасылдан қызылға конверсиясының құрылымдық негізі». Америка Құрама Штаттарының Ұлттық Ғылым Академиясының еңбектері. 102 (26): 9156–9159. Бибкод:2005PNAS..102.9156N. дои:10.1073 / pnas.0501874102. ISSN  0027-8424. PMC  1166600. PMID  15964985.
  8. ^ а б Андо, Риоко; Хама, Хироси; Ямамото-Хино, Мики; Мизуно, Хидеаки; Мияваки, Атсуши (2002-10-01). «Флуоресцентті ақуыздың ультрафиолет индукцияланған жасыл-қызыл фотоконверсиясына негізделген оптикалық маркер». Ұлттық ғылым академиясының материалдары. 99 (20): 12651–12656. Бибкод:2002 PNAS ... 9912651A. дои:10.1073 / pnas.202320599. ISSN  0027-8424. PMC  130515. PMID  12271129.
  9. ^ Лукьянов; т.б. (2005). «Фотоактивті флуоресцентті ақуыздар». Молекулалық жасуша биологиясының табиғаты туралы шолулар. 6 (11): 885–91. дои:10.1038 / nrm1741. PMID  16167053.
  10. ^ а б «mEos2 & mEos4 | Janelia ғылыми кампусы». www.janelia.org. Алынған 2017-11-28.
  11. ^ Фоске, Б. Ф .; Күн, Ю .; Дана, Х .; Янг, C.-T .; Охяма, Т .; Тадросс, М.Р .; Пател, Р .; Златич, М.; Ким, Д.С .; Аренс, М.Б .; Джаяраман, В. (2015-02-13). «Белгіленген кальций интеграторларымен in vivo белсенді жүйке тізбектерін таңбалау». Ғылым. 347 (6223): 755–760. дои:10.1126 / ғылым.1260922. ISSN  0036-8075.
  12. ^ Перес-Альварес, Альберто; Фири, Бренна С .; О'Тул, Райан Дж .; Ян, Вэй; Арганда-Каррерас, Игнасио; Ламоте-Молина, Пол Дж.; Моеяерт, Бенджамиен; Мор, Мануэль А .; Панцера, Лорен С .; Шулце, христиан; Шрайтер, Эрик Р. (2020). «SynTagMA көмегімен синаптикалық белсенділіктің кадрлық кескіні». Табиғат байланысы. 11 (1): 2464. дои:10.1038 / s41467-020-16315-4. ISSN  2041-1723.
  13. ^ «Жаңа люминесценттік протеин нейрондарды тұрақты түрде таң қалдырады». HHMI.org. Алынған 2017-12-01.