Автоматтандырылған патч қысқышы - Automated patch clamp

Автоматтандырылған патч қысқышы басталады[1] нұсқаулықты ауыстыру патчты қысу жеке адамның электрлік белсенділігін өлшеу әдісі ретінде жасушалар. Ұяшықтардан патч қысқыш жазбаларын автоматтандыру үшін әртүрлі әдістер қолданылады жасуша мәдениеті және in vivo. Бұл жұмыс 1990-шы жылдардың аяғынан бастап ғылыми зертханалар мен компаниялардың қолымен патчты қысудың күрделілігі мен құнын төмендетуге тырысып келеді. Ұзақ уақыт бойы патчты қысу өнердің түрі деп саналды және әлі күнге дейін өте көп уақытты алады және жалықтырады, әсіресе in vivo. Автоматтандыру әдістері пайдаланушының қателігін және сапаны алудағы өзгергіштікті азайтуға тырысады электрофизиология бір ұяшықтан алынған жазбалар.

Қолмен патч қысқышы

Негізгі мақала: Патч қысқышы
мәтін
Гигазалау процесін көрсететін анимация. Пипетка ұяшыққа жақындайды, ал пипеткадан ағып жатқан сұйықтық түтігі жасуша бетінде кішкене шұңқыр жасайды. Қарсылық жеткілікті түрде жоғарылаған кезде, пипеткаға аз мөлшерде сорғыш қолданылады жасуша қабығы тамшуыр ұшымен байланыста. Бұл патч қысқыш жазбасына тән гигаомды тығыздауды жасайды.

Шыны тамшуырлар көмегімен қапсырманы жамаудың дәстүрлі қолмен әдісін әзірледі Эрвин Нехер және Берт Сакманн және жоғары білікті техник қажет. Техник шыны тамшуырды ұяшықтың жанына орналастырып, тиісті сорғышты қолданып, тамшуыр мен жасуша мембранасының арасында электрлік тығыздауыш жасайды. Бұл тығыздағыш пипетканың ұшы мен жасуша мембранасы арасында кез-келген токтың ағып кетуіне жол бермей, сапалы жазуды қамтамасыз етеді. Бұл тығыздау жасуша мембранасы пипетканың ішкі жағымен тек пипетканың ұшымен байланыста болатындай етіп пипетканың ұшымен химиялық байланысқан кезде жасалады. цитоплазма жасушаның Бұл мембраналық-шыны қосылыс немесе тығыздауыш «гигазеаль» деп аталады.[2]

Техник дәстүрлі түрде олардың аузын камераға тығыздау үшін қажетті қысымды қамтамасыз ету үшін қолданған. Қысымды бақылаумен қатар, маман пипетканы мембрананың онымен тығыздалуы үшін камерадан дәл қашықтықта орналастыруы керек. A пайдалану микроманипулятор, пипетка пипетка ішіндегі сұйықтық пен оның айналасындағы сұйықтық арасындағы электр кедергісінің өзгергенін көргенге дейін ұяшыққа қарай жылжытады (анимацияны қараңыз). Бұл, әдетте, техник жасушалардан сенімді түрде жазба жасамас бұрын, 3-12 айлық дайындықты қажет етеді. Техник мәні бойынша бірнеше жүйені (қозғалыс, қысым және электр сигналдары) бақылауға және басқаруға тырысатын теңгерімдеу әрекетін орындайды. Егер процестің әр бөлігі дәл және уақытында орындалмаса, пломба дұрыс қалыптаспайды және техник тамшуырды ауыстырып, қайта бастауы керек.

Бұл қиындықтар техник ала алатын жазбалардың санын азайтады және оның құнын едәуір арттырады. Автоматтандыру қолмен қысу уақытын, күрделілігі мен құнын төмендетуге тырысады.

Автоматтандыру жүйелері

Автоматтандыру техникасы жасушалардың қоршаған ортасына байланысты әр түрлі болады. In vivo жасушалар үшін бұл әдетте жасушалар мида және басқа жасушалармен қоршалған дегенді білдіреді. Бұл ортада да бар қан тамырлары, дендриттер, аксондар, және глиальды жасушалар диаметрі 1-2 мкм пипетканың ұшын бітеу арқылы гигаза түзілуін қиындатады. Мұнда пипетканың ұшындағы қысым мен жағдайды нақты бақылау бітелудің алдын алуда және клетканың пипетканың ұшына жақын орналасқандығын анықтауда жоғары рөл атқарады.

Ұяшықтар in vitro сұйықтықта ілініп, өсірілетін тағамға жабысып қалуы немесе жануардан алынған тіннің бөлігі бола алады. Бұл ортада әдетте жануарлардың жүрек соғуы немесе тыныс алуына байланысты тіндердің қозғалысын өтеуге тура келмейді. Суспензиядағы жасушалар жағдайында пипетка гигазеальдар құра алатын және электрлік белсенділікті өлшей алатын саңылаулары бар микрочипке толығымен ауыстырылады. Тығыздау жасушалар мен культура дақылдарындағы тіндерге онша қиындық туғызбайды, себебі жасушалар мен пипетканы микроскоп арқылы көруге болады, бұл техникке қызықтыратын ұяшықтан басқа барлық нәрседен аулақ болуға көмектеседі.

Осы автоматтандырылған жүйелердің әрқайсысы бірнеше тапсырмаларды орындауы керек. Ол ұяшықты пипетканың ұшына немесе 1-2 мкм саңылауы бар басқа құрылғыға орналастырып, тесіктегі қысымды және ұяшық ішіндегі кернеуді басқаруы керек.

In vivo

In vivo патчты қысудың бір мысалы Кодандарамаиа және басқалар көрсетті.[3] Бұл жағдайда қысымды бақылау электронды клапандар жиынтығынан және электронды қысым реттегіштерінен тұрады, бұған дейін техник ұсынған үш қысымды қамтамасыз ететін (жоғары қысым 800-1000мбар, төмен қысым 20-30мбар және шағын вакуум 15-150мбар). Үш электронды клапан үш қысым мен атмосфералық қысым арасында ауысқан. Жоғары қысым тамшуырдың бітелуіне жол бермеу үшін, төмен қысым жасушаларды іздеу кезінде, ал вакуум гигациялау процесіне көмектесу үшін қолданылды. Бұлардың барлығы компьютер арқылы бақыланатын, қысымның арасынан пипетканың ұшындағы қарсылық өзгерген кезде таңдау керек.

Бұл жағдайда позицияны қолмен басқару компьютермен басқарылатынға ауыстырылды пьезоэлектрлік микроманипулятор ол пипетканы жасушамен байланыс орнатқанға дейін матаға дискретті 2-3 мкм қадаммен жылжытады. Бұл дәлдікті басқару қолмен орналастыруға қарағанда әлдеқайда дәл және қайталанатын және операторды қажет етпейді.

Компьютер сонымен қатар электрлік кедергідегі өзгерісті есептейді және бақылайды, өйткені пипетка ұяшықпен байланысқа түседі. Ол пипетканың түбінен шығатын немесе жасуша мембранасымен бітелетін пипеткаға квадрат толқын түрінде кернеу сигналын жібереді. Мембрана оны блоктаған кезде, компьютер пипетканың қозғалысын тоқтатады және гигазеалды қалыптастыру үшін сорғышты қолданады. Бұл автоматика техник шешуі керек болатын шешімдерді жоққа шығарады, ал техниктен айырмашылығы, компьютер бұл міндеттерді қажымай-талмай және дәлдікпен орындай алады.

Бұл әрекеттердің барлығы патчты қолмен қысу сияқты логикалық дәйектілікпен орындалады, бірақ орындау үшін үлкен дайындықты қажет етпейді және оларды компьютер толығымен басқарады. Бұл патч қысқыш жазбаларын алуға кететін шығындарды азайтады және тірі мидағы жазбаның қайталанғыштығы мен беріктігін арттырады.

Суспензияда

Ұяшықтарды пипетканың үстінде орналастыру үшін тамшылы суспензия дақылын және ауырлық күшін қолданатын патч қысқыш жүйесінің сызбасы. Пипетка ішіндегі сорғыш ұяшықтарды пипетканың ұшына қарай тартады, содан кейін гигазеаль түзеді.
мәтін
Гигасеальды, тұтас ұяшықтарды тіркеу конфигурациясын және иондық канал мен тұтас жасушалық токтарды көрсететін патч-қысқыш чиптің схемасы.

Суспензия дақылдарында патчты қысу жасушалары үшін көптеген жүйелер типтері жасалған. Патч қысқыш жазбаларын алу үшін бір жүйе дәстүрлі пипетканы және тамшылардың суспензия культурасындағы ұяшықтарды пайдаланады (суретті қараңыз). Бұл әйнек капиллярын қыздыратын және оны ұзына бойына созатын тамшуырды қысу кезінде қолданылатын конустық ұшты жасау үшін дәстүрлі пипетка жасау жүйелерін пайдаланудың артықшылығы бар.

Суспензия дақылдарының кең таралған автоматика жүйелері гигазеалды құру және бір жасушалардан жазу үшін пипеткалардың орнына жазықтық субстратта ұсақ (1-2 мкм) саңылаулары бар микрочиптерді пайдаланады. Патч чиптері жетілдіру нәтижесінде 2000 жылдардың басында жасалды микрофабрикаттау дамыған технологиялар жартылай өткізгіш өнеркәсіп. Чиптер әдетте жасалған кремний, шыны, PDMS, полимид. Патч чиптік жүйелер әдетте күрделі және қымбат, бірақ параллель және қолмен жұмыс жасаудың қосымша артықшылығы бар.[4][5][6]

Әдетте, нейрондар суспензия дақылдарында өспейді, бірақ жасушалардың басқа түрлері де өсуі мүмкін. Кейбіреулер болуы мүмкін трансфекцияланған мембрананы құру үшін гендермен иондық арналар қызығушылық. Бұл дегеніміз, әдетте электрлік белсенділігі жоқ жасуша өз мембранасында иондық токтар тудыратын иондық арналарды өсіре алады. Суспензия дақылдарында жасушалар бір-бірінен диссоциацияланғандықтан, бір жасушадағы иондық токтарды дәлдікпен өлшеуге болады. Бұл зерттеушілерге басқа жасушалардың ағындарынсыз, әдетте жүйке желілерінде болатындай, басқарылатын ортадағы иондық арналардың әрекеттерін зерттеуге мүмкіндік береді. Бұл әсіресе белгілі бір ақуыз болатын дәрілік скринингтік зерттеулерде өте пайдалы.[7] Жасушаларды суспензиямен өңдеу культурадағы немесе in vivo-дағы клеткалармен жұмыс істеуге қарағанда әлдеқайда жеңіл болғандықтан, патч қысқыш жазбаларын осылайша тезірек және сенімді түрде алуға болады, бұл өнімділікті арттырады, мыңдаған қосылыстардың скринингі мүмкін болады.[8]

Нейрондар алынған дің жасушалары жабысқақ өсіруді суспензияға дейін көтеруге болады және оларды тегіс қапсырма қондырғыларында сәтті қолданды.[9] Сияқты иондық арналар натрийдің кернеулі каналдары, кернеуі бар калий каналдары ионотропты лигандты ионды каналдар лигандпен ашылды GABA автоматтандырылған және қолмен патч қысқышы көмегімен осы ұяшықтардан жазылды.[10]

Мәдениетте

Өсірілген жасушаларды немесе ми тіндерінің тілімдерін автоматтандырылған патчпен қысудың көптеген in vitro әдістері бар.

Біреуі өсірілген жасушалардың өсуіне қарай гигазеаль түзілетін саңылауларға көшуіне себеп болатын беттік өңдеулермен бірге жоғарыда талқыланған патч чипті қолданады.[11] Нейрондардың мәдениетте өсуіне мүмкіндік бере отырып, олар мидың ішіндегі сияқты өздігінен желілерді құрайды, бұл суспензиядағы оқшауланған жасушаларға қарағанда табиғи тіндерге көбірек ұқсайды.

Басқа әдіспен жасушаларды жануардан алып, 2-4 сағат бойы патч чипінде өсіреді, өйткені олар өздігінен гигазеальдар түзеді. полимид және PDMS патч чиптері [12] Бұл жүйе гигазеальдарды қалыптастыру үшін сыртқы жабдықты қажет етпейді.

Басқа әдіс дақылдарда патчты қысу жасушаларының орналасуын автоматтандырады. Ол нанобипетканы дақылға арналған ыдыс ішіндегі сканерлеу үшін пьезо-қозғалатын нақты сатысында қолданады. Сканерлеу кезінде ол пипетканың ұшы мен оның беті немесе жасушалар арасындағы тұрақты электр сыйымдылығын жоғары және төмен жылжыту арқылы сақтайды. (Ұяшыққа жақындаған сайын сыйымдылық жоғарылайды, сондықтан қозғаушы пипетканы алыс жаққа жылжытады және керісінше.) Бұл өсіретін ыдыс ішіндегі беттің дәл топографиялық картасын береді. Ұяшықтарды бейнелегеннен кейін, компьютер пипетканы таңдалған ұяшыққа апарады және онымен бірге гигазеаль түзу үшін оны төмендетеді.[13]

Тағы бір әдіс ұяшықтармен байланыс жасауды автоматтандырады. Оператор үлгіге тамшуырды орналастырады, содан кейін автоматтандырылған бағдарламалық жасақтаманы қабылдауға мүмкіндік береді, пипетканы түсіреді және ұяшықпен байланыс орнатқан кезде тамшуырдағы қарсылықтың жоғарылауын анықтауға тырысады. Осы кезде процесс аяқталады, ал техник гигазеалды қолмен жасайды.

Әзірлеу және қабылдау

Патч-қысқыш автоматика құралдары 2003 жылы сатылымға шықты. Бастапқы жоғары шығындарға байланысты бұл 20-ға жуық технология бастапқыда биотехнология мен фармацевтика индустриясына қызмет етуді көздеді, бірақ соңғы жылдары оның қатысуы академиялық және коммерциялық емес жерлерде өсіп келеді; оның дәлелденген техникалық сенімділігі мен салыстырмалы қол жетімділігін ескере отырып. Университеттер мен басқа да академиялық институттардың саны артып келе жатқан лабораториялар мен негізгі қондырғылар басқа байланыстырылған немесе бір-бірін толықтыратын технологиялармен және әдістермен байланысты және қатар жүретін патч-қысқыш автоматтандырылған аппараттармен жабдықталған.[14] Электрфизиологияның патч-қысқыш автоматикасын қабылдау және тану осы революциялық жаңа технологиямен алынған нәтижелермен жарияланған ғылыми әдебиеттің экспоненциалды өсуінен көрінеді. [15]

Әдебиеттер тізімі

  1. ^ Вуд, С .; Уильямс, С .; Уалдрон, Дж. Дж. (2004). «Сандарды жамау арқылы қысу». Бүгінде есірткіні табу. 9 (10): 434–441. дои:10.1016 / S1359-6446 (04) 03064-8. PMID  15109948.
  2. ^ Хамилл, О. П .; Марти, А .; Нехер, Е .; Сакманн Б .; Сигворт, Ф. Дж. (1981). «Жасушалардан және жасушаларсыз мембраналық патчтардан жоғары ажыратымдылықтағы токты жазу үшін жақсартылған патч-қысқыш техникасы». Pflügers Archiv: Еуропалық физиология журналы. 391 (2): 85–100. CiteSeerX  10.1.1.456.107. дои:10.1007 / BF00656997. PMID  6270629.
  3. ^ Кодандарамаиа, Сухаса Б; Францези, Джованни Талей; Чоу, Брайан Ю; Бойден, Эдвард С; Орман, Крейг Р (2012). «In vivo нейрондардың автоматтандырылған тұтас жасушалы патч-қысқыш электрофизиологиясы». Табиғат әдістері. 9 (6): 585–587. дои:10.1038 / nmeth.1993. ISSN  1548-7091. PMC  3427788. PMID  22561988.
  4. ^ Джонс, К.А .; Гарбати, Н .; Чжан, Х .; Үлкен, C. H. (2009). «QPatch көмегімен автоматты түрде патчты қысу». Өнімділігі жоғары скрининг. Молекулалық биологиядағы әдістер. 565. 209–23 бб. дои:10.1007/978-1-60327-258-2_10. ISBN  978-1-60327-257-5. PMID  19551364.
  5. ^ Чен, С .; Ту, Т.Ю .; Чен, Х .; Джонг, Д.С .; Wo, A. M. (2009). «Ұшақ әйнегіне патчты қысу - сағат саңылауын жасау және иондық каналды жоғары өнімділікті жазу». Чиптегі зертхана. 9 (16): 2370–2380. дои:10.1039 / B901025D. PMID  19636469.
  6. ^ Обергруссбергер, Элисон; Штолль-Фейкс, Соня; Беккер, Надин; Брюггеманн, Андреа; Фертиг, Нильс; Мёллер, Клеменс (2015). «Иондық арналарға арналған дәрілік заттарды скринингтік зерттеу әдістері». Арналар. 9 (6): 367–375. дои:10.1080/19336950.2015.1079675. PMC  4850050. PMID  26556400.
  7. ^ Данлоп Дж .; Боулби, М .; Пери, Р .; Васильев, Д .; Arias, R. (2008). «Өткізгіштік электрофизиология: иондық каналды скрининг пен физиологияның жаңа парадигмасы». Табиғатқа шолулар Есірткінің ашылуы. 7 (4): 358–368. дои:10.1038 / nrd2552. PMID  18356919.
  8. ^ Обергруссбергер, Элисон; Брюггеманн, Андреа; Гетце, Том; Радедиус, Маркус; Хаарман, Клаудия; Ринке, Илка; Беккер, Надин; Ока, Такаюки; Охцуки, Атсуши; Стенгель, Тимо; Фогель, Мариус; Штайндл, Юрген; Мюллер, Макс; Штилер, Йоханнес; Джордж, Майкл; Фертиг, Нильс (2016). «Автоматтандырылған қапсырма қысқышы жоғары өткізгіштік скринингке сәйкес келеді: жазық патч қысқыш модуліне параллель жазылған 384 ұяшық». Зертханалық автоматика журналы. 21 (6): 779–793. дои:10.1177/2211068215623209. PMID  26702021.
  9. ^ Хайторнтвайт, Элисон; Штолл, Соня; Хаслер, Александр; Кисс, Андреа; Мосбахер, Йоханнес; Джордж, Майкл; Брюггеманн, Андреа; Фертиг, Нильс (2012). «Индурирленген плурипотентті бағаналы жасушадан алынған нейрондардағы адамның иондық каналдарын сипаттау». Биомолекулалық скрининг журналы. 17 (9): 1264–1272. дои:10.1177/1087057112457821. PMID  22923790.
  10. ^ Хайторнтвайт, Элисон; Штолл, Соня; Хаслер, Александр; Кисс, Андреа; Мосбахер, Йоханнес; Джордж, Майкл; Брюггеманн, Андреа; Фертиг, Нильс (2012). «Индурирленген плурипотентті бағаналы жасушадан алынған нейрондардағы адамның иондық каналдарын сипаттау». Биомолекулалық скрининг журналы. 17 (9): 1264–1272. дои:10.1177/1087057112457821. PMID  22923790.
  11. ^ Пи; С .; Мартина, М .; Диас-Куижада, Г.А .; Лук, С .; Мартинес, Д .; Денхоф, М. В .; Чарриер, А .; Комалар, Т .; Монетта, Р .; Крантис, А .; Syed, N. I .; Mealing, G. A. R. (2011). «Ұялы функцияны түсінуден есірткінің жаңа ашылуына дейін: План-патч-қапсырма массив чип технологиясының рөлі». Фармакологиядағы шекаралар. 2: 51. дои:10.3389 / fphar.2011.00051. PMC  3184600. PMID  22007170.
  12. ^ Мартинес, Д .; Пи; С .; Денхоф, М. В .; Мартина, М .; Монетта, Р .; Комалар, Т .; Лук, С .; Сайд, Н .; Mealing, G. (2010). «Полимерлі микрочипте өсірілген нейрондардан алынған сенімділіктің патч-қысқыш жазбалары». Биомедициналық микроқұрылғылар. 12 (6): 977–985. CiteSeerX  10.1.1.362.9850. дои:10.1007 / s10544-010-9452-з. PMID  20694518.
  13. ^ Горелик, Дж .; Гу, Ю .; Спор, Х.А .; Шевчук, А. И .; Зертхана, М.Дж .; Хардинг, С. Е .; Эдвардс, В. Уитакер, М .; Мосс, Дж. Дж .; Бентон, Д.Х. Х .; Санчес, Д .; Дарзон, А .; Водяной, Мен .; Кленерман, Д .; Корчев, Ю.Э. (2002). «Кішкентай ұяшықтар мен жасуша құрылымдарындағы иондық арналарды ақылды патч-қысқыш жүйемен зерттеуге болады». Биофизикалық журнал. 83 (6): 3296–3303. Бибкод:2002BpJ .... 83.3296G. дои:10.1016 / S0006-3495 (02) 75330-7. PMC  1302405. PMID  12496097.
  14. ^ Пиконес, А .; Лоза-Хуэрта, А .; Сегура-Чама, П .; Лара-Фигероа, C.O. (2016). «Автоматтандырылған технологиялардың есірткіні ашудағы иондық арналарға қосқан үлесі». Adv Protein Chem Struct Biol. 104: 357–378. дои:10.1016 / bs.apcsb.2016.01.002. PMID  27038379.
  15. ^ Пиконес, А. (2015). «Иондық арналар биологиялық токсиндердің дәрілік нысаны ретінде: автоматтандырылған патч-қысқыш электрофизиологияның әсері». Curr Top Med Chem. 15 (7): 631–637. дои:10.2174/1568026615666150309145928. PMID  25751269.

Сыртқы сілтемелер