Күшейтілген рибосомалық ДНҚ-ны шектеу анализі - Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis

Күшейтілген рДНҚ (рибосомалық ДНҚ) шектеу анализі бұл RFLP техникасын кеңейту (шектеу фрагментінің полиморфизмі ) кодтайтын генге кіші (16s) рибосомалық суббірлік туралы бактериялар. Техникаға 16-шы жылдардағы геннің соңында консервіленген аймақтарға бағытталған праймерлерді қолдану арқылы ферментативті күшейту, содан кейін тетракуттер көмегімен ас қорыту кіреді. Шектеу ферменттері. Алынған үлгіні талданатын түрлердің өкілі дейді. Бірнеше рестриктивті ферменттерден алынған өрнектерді культивирленген изоляттарды және қоғамдастықтан клондау нәтижесінде алынған 16-шы гендерді филогенетикалық сипаттау үшін қолдануға болады. ДНҚ[1]

ARDRA негіздемесі және рәсімі

Ванехут т.б.,[2] бұл әдісті алғашқылардың бірі болып қолданды және оны Mycobacterium және Acinetobacter түрлеріне сипаттама беру үшін қолданды [3] Көптеген басқа зерттеулер ARDRA-ны әртүрлі бактериялық таксондарға қолданды. Шектеу учаскесінің кездейсоқ пайда болу жиілігінің қарапайым формуласына сүйене отырып, 4 а.к. тізбегі 256 а.к.-да бір рет орын алуы мүмкін. 4 тан а.к.-дан астам тану орны бар рестрикт ферменті шамамен 1600 рп генге қатысты болмайды, мысалы, 16 рибосомальды суббірлікті кодтау. Нарықта тетракуттердің шектеуінің бірқатар ферменттері бар. Статистикалық маңыздылық үшін талдау үшін кемінде үш рестрикменттік ферменттер қолданылуы керек, бұл белгілі бір рестриктеу ферменттерінің онша байланысты емес ағзалар үшін ұқсас заңдылықтарды беру ықтималдығын еңсеру керек.

Талдауға жататын ампликон шектеулі алаңның үлкен мүмкіндігіне тап болу үшін 1000 л.с.-тан жоғары өлшемге сәйкес келуі керек. Ас қорыту алдында ампликондарды тазарту керек. Мұны көптеген сатылымда бар тазартқыш жиынтықтары жасай алады. Рестриктивті ферменттерді таңдауға абай болу керек. Белгілі бір шектеу ферменттері бірдей сайттарды таниды және талдауға тиімді үлес қоса алмайды. Түнде 20-500 нг ампликон ДНҚ-ны 20 мкл жүйесінде 4-5 бірлік шектеу ферментімен бірге ұсынылған буфермен бірге белгіленген температурада ұсынылған буфермен бірге ампликон ДНҚ-ны ас қорыту ұсынылады. Асқорытудан кейін реакция тоқтатылады және бүкіл ас қорыту 90-100 В-та 2-3% агарозды гельде өтеді. Гельдің ұзындығы 100-200 а.к. дейінгі кішігірім фрагменттерді дұрыс шешуге мүмкіндік беруі керек.

Үлгілерді талдау қолданылатын әдістермен жүзеге асырылады RAPD өрнектер. Байланысты бактериялардың шоғырларын а түрінде ұсынуға болады кладограмма немесе филограмма. Бастапқы талдаудан кейін көп айнымалы талдау бағдарламасы, мысалы NT-SYS[4] немесе ӨТКЕН[5] 1 (бар болу үшін) және 0 (жоқ үшін) деп белгіленген жолақтардың болуы немесе болмауы туралы мәліметтерді жабдықтау. Деректерді кейіннен а құру үшін пайдалануға болады филограмма немесе кладограмма. Мәліметтер кестесін филогенетикалық ағашты салу үшін қолдануға болады, бұл организмдердің өзара байланысты гендерінен алынған шектеу үлгісіне негізделген өзара байланысын көрсетеді. Осы үлгілерді талдау үшін коммерциялық бағдарламалық жасақтама да қол жетімді, көбінесе GelCompar II және пакеттер қолданылады BioNumerics.

Әдебиеттер тізімі

  1. ^ Скларз, М., Р.Анжел, О.Джиллор және МИМ. Соарес. 2009. Бактериялардың қауымдастығын анықтауға арналған рДНК-ны шектеуді талдаудың күшейтілген талдауын бағалау. Ant van Leeuwenhoek 96: 659-664.
  2. ^ Ванехут, М., Х. Де Бенхауэр, Г. Клэйс, Г. Вершреген, А. Де Рук, Н. Папе, А. Элайхоуни және Ф. Портаэлс. 1993. РДНҚ-ны күшейтетін рестрикциялық анализі бар микобактерия түрлерін анықтау. J. Clin.Микробиол. 31: 2061–2065.
  3. ^ Ванехутте, М., Л.Дайкшоур, И.Тьернберг, А.Элайхоуни, П.Де-вос, Г.Клэйс және Г.Вершреген. 1995. Ацинетобактерлердің геномдық түрлерін күшейту рибосомалық ДНҚ-ны шектеу анализі арқылы анықтау. J. Clin.Микробиол. 33: 11-15.
  4. ^ Exeter бағдарламалық жасақтамасы: NTSYSpc http://www.exetersoftware.com/cat/ntsyspc/ntsyspc.html
  5. ^ Палеонтологиялық статистика: http://folk.uio.no/ohammer/past/